案例一：DAB染色后切片著色一片黃/背景深

背景：奧運(yùn)會(huì)期間我們課題組研究生都在實(shí)驗(yàn)室做實(shí)驗(yàn)，許多從北京購(gòu)買的試劑買不到，對(duì)我們的許多實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了很大的影響。我以前一直用中杉金橋的Sp三步法染色試劑盒，效果不錯(cuò)，在奧運(yùn)會(huì)期間我準(zhǔn)備做同批實(shí)驗(yàn)分不同批次酶免疫組化實(shí)驗(yàn)，*批組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果很好，抗體濃度感覺(jué)比較合適(Santa Cruz公司1：200)，等做第二批時(shí)發(fā)現(xiàn)封閉血清不夠了，為了保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，我又從福州邁新頂了一個(gè)SP試劑盒，同時(shí)抗體稀釋液也不夠了，我又重新從博士德公司買了一小瓶10ml。從第二批實(shí)驗(yàn)開始，組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果一直顯示強(qiáng)背景著色，特異性染色很難辨別。

問(wèn)題及其解答：產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因有哪些?如何解決?

1、 抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。這是zui重要的一條。

2、 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。

3、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高(含血細(xì)胞多的組織)，需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色;

4、 非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果;

5、 DAB孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度過(guò)高;

6、 PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要;

7、 標(biāo)本染色過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。

我的實(shí)際解決方案：

以上的分析可能對(duì)于初學(xué)者還是不容易的，下面我就把我的排除實(shí)驗(yàn)的具體過(guò)程與大家進(jìn)行分享、交流和討論。

1、首先排除抗體孵育條件。一般來(lái)說(shuō)，著色效果的好壞與抗體的孵育條件是密不可分的，由于用SP法已經(jīng)做出來(lái)過(guò)一次且效果不錯(cuò)，因此對(duì)于同樣組織的同一抗原進(jìn)行分析，這種因素可以先排除。

2、其次，DAB孵育時(shí)間是否太長(zhǎng)?做出來(lái)那一次我是孵育8min，后來(lái)也是8-10min，我單獨(dú)做了一次實(shí)驗(yàn)來(lái)排除該因素。結(jié)果孵育2、5min時(shí)先出現(xiàn)背景，而特異性染色較淺，故這不符合常理，一般先出現(xiàn)特異性染色，然后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)非特異性背景著色。

3、zui后，血清封閉的問(wèn)題?以前我一般孵育15-30min，所以我單獨(dú)做了一次實(shí)驗(yàn)用血清封閉室溫1h，其它條件同做出來(lái)的那一次，結(jié)果也一樣背景著色很深。

4、此外，我在改進(jìn)的同時(shí)，也對(duì)PBS清洗不斷地延長(zhǎng)時(shí)間和增加次數(shù)，甚至*參照試劑盒說(shuō)明書來(lái)進(jìn)行操作(我以前一般一抗4度且室溫復(fù)溫45min、二抗37度30min、Sp反應(yīng)37度30min)，以及過(guò)氧化氫滅活加強(qiáng)等等均未起到效果。

我冷靜地分析了一下整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，與*次做出來(lái)相比，只有兩個(gè)地方做了改動(dòng)：因血清不夠而更換了不同廠家試劑盒、因抗體稀釋液用完而重新買了抗體稀釋液。

5、我用PBS替代一抗稀釋液(我以前還回收抗體，自我覺(jué)得抗體稀釋液中含防腐劑和蛋白穩(wěn)定劑)，其它步驟和組織切片*與*次做出來(lái)的一致(包括血清也是老試劑盒內(nèi)剩余的一點(diǎn))，奇跡出現(xiàn)了：結(jié)果很好。--因?yàn)榭乖贵w反應(yīng)除溫度、抗原/抗體濃度外，然后就是PH值，于是我測(cè)了新抗體稀釋液、老抗體稀釋液和PBS的PH值，結(jié)果是前者偏酸性(<6、0)，而后兩者均在7、5左右。

6、看來(lái)主要禍根是抗體稀釋液的PH值出問(wèn)題了，于是我又用PBS替代抗體稀釋液和新試劑盒內(nèi)的試劑對(duì)組織切片做了免疫組化，結(jié)果還是沒(méi)有做出來(lái)：背景很深。這真把我搞慘了。難道還有什么原因嗎?通過(guò)仔細(xì)分析：一抗一定是結(jié)合上去了(老SP試劑盒結(jié)果很好)，問(wèn)題是二抗沒(méi)有結(jié)合上去也不對(duì)(因?yàn)閦ui后背景很深，這說(shuō)明二抗可能也結(jié)合上去了)，DAB孵育時(shí)間現(xiàn)在只用1、5min也是背景深而特異性染色淺，那我又懷疑封閉血清了。

7、我做了兩張切片：一張用老試劑盒內(nèi)還剩下一點(diǎn)的血清而另一張用新試劑盒內(nèi)的封閉血清，其余試劑(二抗、SP)均用新試劑盒提供的，結(jié)果是前一張效果很好，而后一張能夠看到特異性染色，但背景太深，拍照效果不佳。--看來(lái)封閉血清也是罪會(huì)禍?zhǔn)字弧?/p>

結(jié)果分析顯示：抗體稀釋液的PH值偏低和封閉血清的失效導(dǎo)致了我的免疫組化結(jié)果的不佳，望大家在以后的組化實(shí)驗(yàn)中也要注意這兩個(gè)不太引人注意的關(guān)鍵問(wèn)題。--慘痛的教訓(xùn)，值得引以為鑒。

案例二：DAB染色后切片著色呈陰性結(jié)果

背景：其實(shí)免疫組化在DAB染色后一般有四種情況：陽(yáng)性染色效果很好、陰性染色、非特異性染色很深、陰陽(yáng)臉(染色不均勻)。而陰性染色是許多初學(xué)者經(jīng)常遇到的頭疼問(wèn)題。我身邊有個(gè)研究生同學(xué)在我們實(shí)驗(yàn)室初次涉入免疫組化，聽說(shuō)步驟不難，跟我后面做了幾次之后，就自己開始做了，連續(xù)做了三次，結(jié)果均是陰性染色。很掃興，不知是什么原因?qū)е碌摹?/p>

問(wèn)題及其解答：免疫組化染色呈陰性結(jié)果的原因有哪些?

1、抗體濃度和質(zhì)量問(wèn)題以及抗體來(lái)源選擇錯(cuò)誤。不知抗體是進(jìn)口的還是國(guó)產(chǎn)的工作液，怎么這么高稀釋度也沒(méi)能做出陽(yáng)性結(jié)果?另外，不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng)，必須摸索*濃度。

2、抗原修復(fù)不全，對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來(lái)打開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合;建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試。有人做過(guò)實(shí)驗(yàn)，這是*的時(shí)間和次數(shù)。若不行，還可高壓修復(fù)。

3、組織切片本身這種抗原含量低;

4、血清封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

5、DAB孵育時(shí)間過(guò)短。

6、細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)。

7、開始做免疫組化，我建議你一定要首先做個(gè)陽(yáng)性對(duì)照片，排除抗體等外的方法問(wèn)題。

我的實(shí)際解決方案：

1、首先，排除組織切片內(nèi)的抗原有無(wú)丟失及其含量多少。免疫組化中兩個(gè)zui重要的因素是抗原和抗體。(1)抗原有無(wú)丟失主要看組織切片的新鮮程度，一般切片室溫保存超過(guò)3-6個(gè)月，可能切片內(nèi)的抗原丟失很嚴(yán)重(有文獻(xiàn)支持)，此時(shí)可以通過(guò)重新用石蠟塊切片來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證(蠟塊需要低溫保存)。(2)石蠟切片在制作過(guò)程中可能因醛基對(duì)抗原決定族的封閉，這需要通過(guò)抗原修復(fù)來(lái)充分暴露，從而增加抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，提高陽(yáng)性率，我一般用6min*4次中火微波抗原修復(fù)，用枸櫞酸鈉緩沖液。(3)組織切片中本身抗原含量的多少?這方面我有教訓(xùn)的，我做胎鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞鑒定，用1：200一抗效果很好;但我用1：200一抗孵育成年睪丸間質(zhì)細(xì)胞檢測(cè)，幾乎呈陰性，后來(lái)證實(shí)是因?yàn)閮烧呖乖肯嗖钌踹h(yuǎn)，則一抗也要適當(dāng)提高濃度。

2、其次，檢查抗體有無(wú)選擇錯(cuò)誤和抗體孵育條件是否不適。(1)一抗選擇單克隆抗體易出現(xiàn)陰性結(jié)果，因?yàn)殪`敏度低但特異性好;一抗的species reactivity中無(wú)檢測(cè)組織的種屬，這是比較常見(jiàn)的錯(cuò)誤;一抗選擇rat，而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出現(xiàn)陰性結(jié)果。(2)抗體孵育時(shí)間過(guò)短，容易導(dǎo)致陰性結(jié)果。一般一抗我建議4度孵育和37度復(fù)溫45min;二抗我一般37度30min。我不喜歡參照二抗染色試劑盒說(shuō)明書。(3)抗體濃度過(guò)低。這是陰性結(jié)果的zui可能原因。必須提高稀釋度，我一般初次做一種新抗體，喜歡先用說(shuō)明書建議的低濃度和高濃度做一次，然后決定是向高還是低方向摸索。一般先決定二抗的濃度(工作液就好辦了，直接滴加)，重點(diǎn)摸索一抗的zui適濃度。注意：免疫反應(yīng)中存在前帶和后帶效應(yīng)，這提示不是濃度越高，陽(yáng)性率就越高，反之亦然。(4)重要原因排除之后，也不要忽視抗體的質(zhì)量：原裝抗體一般比較穩(wěn)定，效果較好;而進(jìn)口分裝次之;工作液可能要注意質(zhì)量問(wèn)題。

3、同時(shí)，DAB的孵育時(shí)間可能要適當(dāng)延長(zhǎng)，在鏡下觀察，有時(shí)可延長(zhǎng)至30min。但一般3-10min，此時(shí)背景也較淺。否則，說(shuō)明抗體濃度不合適。

4、zui后，血清封閉時(shí)間也可相應(yīng)縮短。一般10-30min，但這個(gè)時(shí)間可以調(diào)整，封閉主要是降低切片的總體背景著色。

5、此外，細(xì)胞通透也不可忽視。許多戰(zhàn)友認(rèn)為石蠟切片一般不需細(xì)胞通透，因?yàn)榍衅瑫r(shí)可能已經(jīng)把細(xì)胞切開了，但對(duì)于胞核蛋白，建議還是通透一下，促進(jìn)抗體等試劑充分進(jìn)入?yún)⑴c反應(yīng)。

6、以上原因，都是針對(duì)實(shí)際中常見(jiàn)原因來(lái)進(jìn)行分析的，前提是排除操作者的操作錯(cuò)誤而引起陰性結(jié)果，這就需要新手還是要設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照以排除方法的問(wèn)題。還有抗體稀釋液的PH值過(guò)低等其它原因的干擾。

總之，要想把免疫組化做好，可能每一個(gè)環(huán)節(jié)都很重要，但也存在主次之分，出現(xiàn)問(wèn)題了，需要通過(guò)先排除主要的，再依次排除次要的--這是衡量你對(duì)免疫組化原理掌握與否的關(guān)鍵所在。

案例三：石蠟切片免疫熒光染色呈陰性結(jié)果或非特異性結(jié)果

背景：因?qū)嶒?yàn)需要，于2008年07月04日初次做肝臟組織ZO-1(一種胞膜蛋白，緊密連接蛋白)免疫熒光染色，以前我對(duì)酶免疫組化非常熟悉，在園子內(nèi)也有不少置頂貼和精華帖，但免疫熒光一直還沒(méi)做過(guò)(原理知道，但細(xì)節(jié)不太了解)。我先用石蠟切片做了5次，結(jié)果一直不理想(表現(xiàn)為未見(jiàn)特異性強(qiáng)染色);近幾日，我又切了冰凍切片，做了2次，終于基本成功了。在這個(gè)過(guò)程中，我對(duì)免疫熒光染色技術(shù)有了全新的認(rèn)識(shí)，而前些天發(fā)出免疫熒光求助貼，回復(fù)的很少，所以有必要加強(qiáng)對(duì)免疫熒光方面的討論)，不妥之處敬請(qǐng)指正。有人會(huì)問(wèn)酶免疫組化做的好好的，為何要做免疫熒光?其實(shí)，這也是我以前思考的難題，現(xiàn)在我認(rèn)為可能胞膜蛋白含量不高，用普通免疫免疫組化可能做不出來(lái)，需要敏感的免疫熒光方法來(lái)進(jìn)行蛋白檢測(cè)(我是看許多外文文獻(xiàn)都是這樣做的，因此選擇免疫熒光染色。)

問(wèn)題及其解答：如何降低非特異性熒光染色和避免陰性著色?

1、非特異性染色產(chǎn)生原因及其解決方案：

(1)游離熒光素殘留在二抗中。一部分熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。二抗配置時(shí)用透析法或?qū)游龇ǚ蛛x熒光素標(biāo)記的二抗和游離的二抗。購(gòu)買高質(zhì)量、高純度的熒光素二抗。

(2)抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結(jié)合。

(3)組織抗原封閉不全。除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原(如Forssman氏抗原)，可與組織中特異性抗原以外之之相應(yīng)抗體結(jié)合。延長(zhǎng)血清封閉時(shí)間。

(4)從組織中難于提純抗原性物質(zhì)，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。

(5)抗體分子上標(biāo)記的熒光素分子太多，這種過(guò)量標(biāo)記的抗體分子帶過(guò)多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。

(6)熒光素不純、標(biāo)本固定不當(dāng)?shù)取?/p>

(7)一抗和二抗孵育條件和濃度不合適。調(diào)整一抗和二抗孵育條件和濃度至*。

(8)一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次數(shù)和延長(zhǎng)清洗時(shí)間。

2、陰性染色產(chǎn)生的原因有：

(1)一抗和二抗?jié)舛炔缓线m或孵育條件不妥。

(2)熒光素提前衰退。熒光素質(zhì)量不佳或操作過(guò)程中沒(méi)有注意避光等防止熒光素衰退的事項(xiàng)。

(3)血清封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

(4)抗體稀釋液PH值不合適，影響抗原抗體反應(yīng)。

(5)組織切片不平、裂片或脫片很嚴(yán)重，易引起大塊陰性著色。

(6)組織標(biāo)本不新鮮或已經(jīng)冷凍組織制成的切片中抗原易彌散，易引起本來(lái)表達(dá)的部位陰性染色或弱著色。

(7)熒光顯微鏡不會(huì)使用，激發(fā)波長(zhǎng)選擇錯(cuò)誤。

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