信帆生物為大家提供：Western Blot實(shí)驗(yàn)操作寶典！

western免疫印跡(Western Blot)是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測。對已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。

一、原理

與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。

二、試劑準(zhǔn)備

1. SDS-PAGE試劑:見電泳實(shí)驗(yàn)。

2. 勻漿緩沖液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.0ml;10%SDS 6.0ml;β-巰基乙醇 0.2ml;ddH2O 2.8ml。

3. 轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9g;Tris 5.8g;SDS 0.37g;甲醇200ml;加ddH2O定容至1000ml。

4. 0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g;KCl 0.2g;Na2HPO4 1.44g;KH2PO4 0.24g;加ddH2O至1000ml。

5. 膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2g;甲醇80ml;乙酸2ml;ddH2O118 ml。包被液(5%脫脂奶粉，現(xiàn)配)：脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。

6. 顯色液：DAB 6.0mg;0.01M PBS 10.0ml;硫酸鎳胺 0.1ml;H2O2 1.0μl。

三、操作步驟

1. 蛋白質(zhì)樣品獲得：細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)后，可通過電泳上樣緩沖液直接裂解細(xì)胞，真核細(xì)胞加勻漿緩沖液，機(jī)械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然后4℃，13,000g離心15min。取上清液作為樣品。

2. 電泳：制備電泳凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE。

3. 轉(zhuǎn)移：(半干式轉(zhuǎn)移)

① 電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，5min×3次。

②膜處理：預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10min。

③ 轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜對齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多余的液體吸干。接通電源,恒流1mA/cm2，轉(zhuǎn)移1.5hr。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源將膜取出,割取待測膜條做免疫印跡。將有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風(fēng)干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結(jié)果作對比。

四、免疫反應(yīng)：

1. 用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。

2. 加入包被液，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2hr。

3. 棄包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。

4. 加入一抗(按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋，液體必須覆蓋膜的全部)，4℃ 放置12hr以上。陰性對照，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。

5. 棄一抗和1%BSA，用0.01M PBS分別洗膜，5min×4次。

6. 加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋)，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2hr。

7. 棄二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。

8. 加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng)。

四、注意事項(xiàng)

1、一抗、二抗的稀釋度、作用時(shí)間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定*條件。

2、顯色液必須新鮮配置使用，zui后加入H2O2。

3、DAB有致癌的潛在可能，操作時(shí)要小心仔細(xì)。